Etude des relations "O-GlcNAcylation et microdomaines lipidiques"

La O-GlcNAcylation est une modification post-traductionnelle appartenant au groupe des glycosylations. C est une modification dynamique, analogue à la phosphorylation, dont la réversibilité est contrôlée par un couple d enzymes, la O-GlcNAc transférase (OGT) et la O-GlcNAcase (OGA). Bien que les fonctions de la O-GlcNAcylation aient été étudiées à différents niveaux de régulation cellulaire, aucune étude n a porté jusqu ici sur sa localisation potentielle au niveau des radeaux lipidiques (rafts). Or, il a été récemment démontré que l élévation des niveaux de O-GlcNAcylation participait activement au phénomène de résistance à l insuline et un nombre important de preuves a également été apporté sur le rôle critique des microdomaines lipidiques dans ce phénomène de résistance. On sait également depuis peu qu après stimulation par l'insuline, l OGT est recrutée à la membrane plasmique par l'intermédiaire de son domaine PPO (PIP-binding activity of OGT), et que cette relocalisation inactive la voie de signalisation PI3-kinase/Akt par antagonisme vis-à-vis de la phosphorylation. Ces trois observations suggèrent que l OGT puisse constituer un relai essentiel permettant de transmettre l information portée par des stimuli externes au travers de la membrane plasmique, et plus particulièrement des rafts, par le biais d une régulation des voies de signalisation. Au cours de ma thèse, nous avons adapté une technique permettant de purifier les microdomaines lipidiques, en procédant par une extraction par le détergent CHAPSO suivi d'une étape d'ultracentrifugation. Nos expériences ont montré pour la première fois la localisation de l OGT et de protéines O-GlcNAcylées, parmi lesquelles nous avons identifié la chaîne bêta du récepteur de l'insuline et Hsp70, au niveau des microdomaines lipidiques. Le recrutement de ces éléments est contrôlé par l insuline: nous avons en effet observé une association progressive de la glycosyltransférase aux microdomaines lipidiques après stimulation par cette hormone. Nous avons démontré que, en réponse à l'insuline, l OGT est recrutée au niveau des lipides rafts, ce qui suggère une régulation négative de la voie PI3-Kinase/Akt par O-GlcNAcylation, au niveau des microdomaines lipidiques. Cette étude est la première suggérant une relation directe entre la O-GlcNAcylation des protéines associées aux rafts et la régulation de la signalisation cellulaire par l'insuline. En marge de ses travaux, nous avons mis en évidence l'existence de la O-GlcNAcylation chez les deux parasites apicomplexes Toxoplasma gondii et Plasmodium falciparum. Une approche biochimique et bioinformatique a également permis de prouver l'existence propre de l'OGT chez le toxoplasme.The attachment of O-linked beta-N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) to proteins is a post-translational modification belonging to the group of glycosylations. This is a dynamic modification, analogous to phosphorylation, which reversibility is controlled by a couple of enzymes, namely the O-GlcNAc transferase (OGT) and O-GlcNAcase (OGA). Although the functions of O-GlcNAcylation have been studied at different levels of cell regulation, until now none study refers its potential location at the level of lipids microdomains (rafts). Nevertheless, it has been recently shown an elevation of the O-GlcNAcylation levels are actively involved in the phenomenon of insulin resistance and a significant number of publications also reports the critical role of lipid microdomains in this phenomenon of resistance. Little while ago, we know that after stimulation with insulin, the OGT is recruited to the plasma membrane through its PPO domain (PIP-binding activity of OGT), and that this relocation inactivates the PI3-kinase/Akt signaling pathway by exerting an antagonistic effect on its phosphorylation. These three observations suggest that OGT may play an essential role in signal transmission through its interaction with the plasma membrane and more particularly with the lipid microdomains. During my thesis, we first adapted a technique to purify lipid microdomains, using a method combining an extraction with the detergent CHAPSO followed by an ultracentrifugation. Our experiments show for the first time that OGT and some O-GlcNAcylated proteins, among which we identified the insulin receptor beta-chain and Hsp70, are located in lipid rafts. The recruitment of these elements is controlled by insulin: we indeed observed a progressive association of the glycosyltransferase to the lipid microdomains after stimulation by this hormone. We demonstrated that in response to insuline, the OGT is recruited to lipid rafts, suggesting a down-regulation of the PI3-Kinase/Akt pathway by O-GlcNAcylation at the level of the lipid microdomains. This study is the very first suggesting a direct relationship between the O-GlcNAcylation of the lipid rafts-associated proteins and the regulation of cell signaling by insulin. In margin of these works, we have brought to the fore O-GlcNAcylation in the two apicomplexan parasites Toxoplasma gondii and Plasmodium falciparum. A biochemical and bioinformatic study led us to prove that toxoplasma possesses its own OGT.LILLE1-Bib. Electronique (590099901) / SudocSudocFranceF